人外周血B、T淋巴細(xì)胞的分離方法
目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細(xì)胞。
方法:
1. 在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶(如下圖)，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。
單個核細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)／1毫升細(xì)胞懸液)＝
4個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)
────────── × 104×2(稀釋倍數(shù))
4
6. 細(xì)胞活力檢測：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計數(shù)200個淋巴細(xì)胞。計算出活細(xì)胞百分率。
活細(xì)胞數(shù)
活細(xì)胞百分率＝────── ×100％
總細(xì)胞數(shù)
用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。
-
科技前沿
