膠體金免疫層析法快速檢測(cè)腹瀉性貝毒軟海綿酸的研究

　　劉仁沿1 , 梁玉波3 1 , 陳　媛2 , 許道艷1 , 陳冰君1 , 劉永健1

　　(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,遼寧大連116023 ;

　　2. 江西中德生物工程有限公司,江西南昌330029)

　　摘　要:腹瀉性貝毒是一類分布較廣的赤潮毒素,嚴(yán)重威脅到人類的健康和安全。本文用膠體金標(biāo)記利用細(xì)胞融合技術(shù)制備的抗軟海綿酸單克隆抗體,使用卵清蛋白合成高偶聯(lián)比的包被抗原,以硝酸纖維素膜為載體,利用免疫層析技術(shù)原理,建立了快速檢測(cè)軟海綿酸的免疫層析試紙條方法。方法檢出限12 ng/ mL (0. 96 納克/ 條) 。

　　關(guān)鍵詞:軟海綿酸;單克隆抗體;免疫層析;膠體金

　　中圖分類號(hào):O658. 1+ 1 　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 　　文章編號(hào):100626144(2010) 0120031204

　　近年有毒赤潮頻發(fā),對(duì)我國(guó)海洋生態(tài)和漁業(yè)資源造成了巨大損害,赤潮毒素對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)及人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。腹瀉性貝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning ,DSP) 是由有毒赤潮藻類鰭藻屬( Di2nop hysis) 和原甲藻屬( Prorocent rum) 產(chǎn)生的一類脂溶性多環(huán)醚類天然化合物,主要成分是軟海綿酸(Okadaic Acid ,OA) 及其衍生物,能引起食用者腹瀉、惡心等。腹瀉性貝毒能激發(fā)磷酸化來(lái)控制大腸細(xì)胞內(nèi)鈉的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A 和PP2A 的強(qiáng)烈抑制劑,也是一種很強(qiáng)的促癌劑,能引起消化道腫瘤的發(fā)生[ 1 ] 。我國(guó)海產(chǎn)品特別是貝類受腹瀉性貝毒沾污越來(lái)越嚴(yán)重[223 ] 。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法以及一些免疫化學(xué)方法。小鼠生物法簡(jiǎn)便易行,適合于大規(guī)模、批量樣品的檢測(cè),但不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu),干擾大、不精確。高效液相色譜法( HPLC) ,特別是液2質(zhì)聯(lián)用技術(shù),可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類,檢出限可低至ng/ g ,但樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí),且儀器昂貴[ 4 ] 。

　　因此,建立快速、靈敏的赤潮毒素檢測(cè)方法,有利于開展大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)和生物樣品監(jiān)測(cè)計(jì)劃,對(duì)推動(dòng)貝類毒素研究和保障人體健康十分重要。

　　免疫化學(xué)方法是基于抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合的一種分析方法,具有靈敏度高,特異性強(qiáng),器設(shè)備簡(jiǎn)單,方法易掌握,樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大量樣本快速篩查,因而,近年在分析化學(xué)領(lǐng)域受到極大的重視且發(fā)展迅速[526 ] 。現(xiàn)已有售德國(guó)、日本等公司生產(chǎn)的EL ISA 檢測(cè)DSP 的試劑盒。

　　國(guó)內(nèi)已有關(guān)于OA 抗體制備和EL ISA 檢測(cè)方法的報(bào)道[729 ] ,有關(guān)腹瀉性貝毒膠體金檢測(cè)方法的研究也有報(bào)道[ 10 ] 。國(guó)內(nèi)尚未見應(yīng)用免疫層析技術(shù)用于分析DSP 的報(bào)道。本文用膠體金標(biāo)記抗體,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng),研制快速檢測(cè)OA 的免疫層析試紙條技術(shù),為我國(guó)腹瀉性貝毒監(jiān)測(cè)提供快速分析方法。

　　1 　實(shí)驗(yàn)部分

　　1. 1 　主要儀器、試劑與材料

　　BIODOT 切割機(jī),XYZ23000 噴點(diǎn)儀購(gòu)自Biodot公司;JASCO V2550 紫外/ 可見分光光度計(jì);恒溫干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、試紙條模具均為國(guó)產(chǎn)。

　　膠體金檢測(cè)用樣本墊(玻璃纖維素膜,10 ×300 mm) 、膠金墊(玻璃纖維素膜,8 ×300 mm) 吸水紙(14×300 mm) 均購(gòu)自Millipore 公司;硝酸纖維素膜(NC 膜,25 ×300 mm) 購(gòu)自Sartorius 公司。40 nm 膠體金,用1 %檸檬酸三鈉水溶液燒制還原0. 01 %氯金酸水溶液,批量制備紫紅色的膠體金溶液,最大吸收波長(zhǎng)538 nm ,其它試劑均為分析純。

　　1. 3 　實(shí)驗(yàn)方法

　　1. 3. 1 　抗軟海綿酸單克隆抗體及包被抗原的制備　本室自制OA2OVA 偶聯(lián)抗原(4. 65 mg/ mL) 和抗OA2KL H 單克隆抗體腹水,制備方法和性質(zhì)鑒定見參考文獻(xiàn)[9 ] 。

　　1. 3. 2 　單克隆抗體腹水的純化　用辛酸硫酸胺方法純化得到粗抗體,再用0. 01 mmol/ L 的磷酸鹽緩沖液( PBS ,p H = 7. 4) 透析4～5 d。用分光光度計(jì)測(cè)得抗體蛋白濃度為1. 78 mg/ mL 。

　　1. 3. 3 　包被抗原濃度篩選　OA2OVA 偶聯(lián)抗原用PBS 稀釋,稀釋倍數(shù)分別為原液、稀釋2 倍、稀釋4 倍,稀釋后點(diǎn)在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用。

　　抗原噴NC 膜:抗原用PBS 稀釋4 倍后用XYZ23000 噴點(diǎn)儀噴NC 膜,噴量為:0. 74 μL/ cm , Y = 16cm ,37 ℃干燥過(guò)夜,備用。

　　1. 3. 4 　金標(biāo)抗體的制備　抗體標(biāo)記量為20μg/ mL 。先取20 mL 40 nm 的膠體金于干凈的燒杯中,用1 mmol/ L的NaOH調(diào)節(jié)其p H 值為8. 2 ,加入抗體,使其在膠體金中濃度為20μg/ mL ,攪拌1 h ,加入膠體金1/ 10 體積的10 %牛血清白蛋白溶液,攪拌30 min ,5 000 r/ min 離心30 min ,取沉淀,用PBS 復(fù)溶,約加入4 mL 緩沖液,用紫外分光光度計(jì)掃描膠體金特征吸收峰,確定膠體金OD 值后用PBS 緩沖液稀釋,使其OD 值為5 ,分成100μL/ 管,插入點(diǎn)好各種抗原濃度的NC 膜,觀察NC 膜顯色情況,確定用稀釋4 倍的抗原篩選抗體標(biāo)記濃度。

　　抗體標(biāo)記量的選擇:按照金標(biāo)抗體的制備方法,標(biāo)記不同濃度的抗體量,分別為20 、15 、10 、5μg/ mL ,配制適當(dāng)濃度,使其OD 值為5 ,用XYZ23000 噴點(diǎn)儀將金標(biāo)抗體噴在膠金墊上,噴金量分別為10 、8 、6 、4μL/ cm ,真空干燥2 h ,備用,抗體共計(jì)16 個(gè)梯度條件。

　　1. 3. 5 　貝類樣品處理方法　貝類樣品的測(cè)定:取新鮮的扇貝,去殼,勻漿,取少許勻漿,加入OA 標(biāo)準(zhǔn)品,使其含量為20μg/ 100 g ,取加標(biāo)勻漿,用4 倍體積(m∶V = 1∶4) 的80 %甲醇2水超聲萃取5 min ,離心,上清液用PBS 稀釋3 倍,在96 孔加樣板上,加80μL/ 孔,另加80μL/ 孔PBS 為對(duì)照。

　　2 　結(jié)果與討論

　　2. 1 　檢測(cè)原理和條件

　　腹瀉性貝毒免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理,樣本中軟海綿酸OA 在流動(dòng)過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合,抑制了抗體和NC 膜檢測(cè)線上OA2OVA 偶聯(lián)抗原的結(jié)合。

　　如果樣本中OA 含量大于12 ng/ mL ,檢測(cè)線不顯顏色,結(jié)果為陽(yáng)性;反之,檢測(cè)線顯紅色,結(jié)果為陰性。16 個(gè)抗體條件的金墊,分別和稀釋4 倍的NC 膜組裝成試紙條,用PBS 檢驗(yàn)顯色程度。結(jié)果顯色均很深。降低抗體標(biāo)記量,用稀釋4 倍的NC 膜檢測(cè)和調(diào)節(jié)抗體標(biāo)記量,經(jīng)過(guò)細(xì)微摸索抗原濃度,最后確定用PBS 稀釋8 倍的檢測(cè)抗原制備NC 膜,0. 74μL/ cm。

　　降低標(biāo)記量為5、4、3、2μg/ mL , 調(diào)制OD 值為4、5、6 , 噴金量為2、2. 5、3、3. 5、4、6、8μL/ cm ,共84 個(gè)金標(biāo)抗體條件和稀釋8 倍的包被抗原NC 膜組裝,分別用空白(0. 01 mmol/ L PBS) 、PBS 稀釋的軟海綿酸OA 標(biāo)準(zhǔn)品20、15、12、10 ng/ mL 檢測(cè)顯色程度和陽(yáng)

　　性抑制濃度。加樣量為80μL/ 孔,判斷時(shí)間為15 min。最終選擇標(biāo)記量為:2μg/ mL ,OD 為5 ,噴3μL/ cm ,組裝雙金墊,NC 膜為原液稀釋8 倍的抗原條件組裝成試紙條,檢出限為12 ng/ mL 。

　　重復(fù)性實(shí)驗(yàn):按照上述實(shí)驗(yàn)條件,重新標(biāo)記抗體并噴抗原,組裝條件一致的試紙條,檢測(cè)結(jié)果和原條件實(shí)驗(yàn)一致(圖1) ,空白液顯色一般(0 號(hào)卡) ,陽(yáng)性12 ng/ mL 完全抑制無(wú)條帶出現(xiàn)(8號(hào)卡) 。

　　貝類DSP 毒素提取需要80 %的甲醇2水溶液,有機(jī)溶劑會(huì)干擾抗原抗體反應(yīng),因此在PBS 緩沖液中添加不同濃度甲醇實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:檢測(cè)樣本中含30 %以下甲醇對(duì)免疫學(xué)反應(yīng)無(wú)影響。小鼠法陰性樣品驗(yàn)證了此結(jié)果(圖2) 。小鼠法陽(yáng)性樣品有部分抑制,條帶顏色比空白淺(圖3) 。

　　對(duì)于加標(biāo)貝樣萃取液的測(cè)定結(jié)果表明,15 min 內(nèi)空白對(duì)照顯紅色條帶,而貝樣的萃取液(含OA 16. 7ng/ mL) 無(wú)顏色條帶出現(xiàn)。當(dāng)貝類勻漿用5 倍體積的80 %甲醇2水萃取時(shí)(含OA 13. 3 ng/ mL) ,實(shí)驗(yàn)結(jié)果在15 min 內(nèi)無(wú)顏色條帶出現(xiàn),但放置長(zhǎng)時(shí)間(大于2 h) 后,會(huì)出現(xiàn)極淺的條帶印跡。因此對(duì)于OA 含量稍高于或接近于檢出限12 ng/ mL 的樣品,一定要嚴(yán)格控制檢測(cè)時(shí)間,在15 min 內(nèi),與空白對(duì)照,得出結(jié)果,當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)由于極少量的金標(biāo)抗體抗原復(fù)合物的長(zhǎng)時(shí)間附著積累,以及其他一些非特異性吸附反應(yīng)等的作用,而干擾試驗(yàn)結(jié)果的判斷。

　　2. 2 　檢出限與食品安全閾值

　　一些國(guó)家規(guī)定的貝類組織中腹瀉性貝毒安全閾值是20μg OA 等價(jià)物/ 100 g 貝肉,我國(guó)《有毒赤潮監(jiān)測(cè)嶄行規(guī)范》推薦20μg OA 等價(jià)物/ 100 g 貝肉的限定值。

　　應(yīng)用研制的靈敏專一的抗軟海綿酸單克隆抗體,研究建立的貝類腹瀉性貝毒主要成份軟海酸的免疫快速檢測(cè)卡(檢出限12 ng/ mL ,時(shí)間15 min) ,不需要任何儀器設(shè)備,完全滿足該規(guī)定閾值,應(yīng)用于貝類樣品中軟海綿酸的檢測(cè)。

　　2. 3 　免疫層析檢測(cè)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的比較

　　免疫層析與酶聯(lián)免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)而建立的免疫檢測(cè)技術(shù)。使用同一種抗體建立的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法比免疫層析檢測(cè)方法靈敏度高,但分析步驟多,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(2. 5 h) ,定量檢測(cè)需使用酶標(biāo)儀完成;而免疫層析快速檢測(cè)方法雖然靈敏度低,但只使用一種試劑,一步操作,可在室溫長(zhǎng)期保存,具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染、不需任何檢測(cè)儀器的優(yōu)點(diǎn),特別適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)篩選陽(yáng)性樣品,然后使用色譜等儀器方法驗(yàn)證鑒定。對(duì)于半定量的快速現(xiàn)場(chǎng)篩選具有其他方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

　　2. 4 　建立免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵因素

　　本研究組曾制備抗OA2BSA 單克隆抗體,由于特異性不高,最大抑制率只有30 % ,建立的免疫層析檢測(cè)方法靈敏度低,不具有可用于實(shí)際樣品檢測(cè)的使用價(jià)值[11 ] ;而本研究中使用的抗OA2KL H 單克隆抗體,特異性高,最大抑制率可達(dá)到90 %以上,因此使用其建立的免疫層析檢測(cè)方法靈敏度高,能夠滿足實(shí)際樣品安全規(guī)定值的檢測(cè)需要,建立的分析方法具有實(shí)用價(jià)值。

　　結(jié)合率高的包被抗原。因?yàn)镺A 是小分子,不能直接吸附到硝酸纖維膜上,必需偶聯(lián)到大分子蛋白載體上。偶聯(lián)的分子比是影響檢測(cè)方法成功的關(guān)鍵因素之一。噴點(diǎn)在檢測(cè)線上的包被抗原 OA2OVA ,必需具有較高的OA 結(jié)合比,才能夠使得競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的金標(biāo)記抗體的量能夠產(chǎn)生肉眼可識(shí)別的顏色變化,而達(dá)到檢測(cè)的目的。

　　建立一種物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的影響因素非常多。盡管在理論上已經(jīng)很成熟,可實(shí)際中成功率并不高,尤其對(duì)于小分子的間接競(jìng)爭(zhēng)方法,困難更多。這是一個(gè)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,涉及到眾多的條件因素。除了上述因素外,膠體金顆粒粒徑的大小范圍,以及顆粒的均一性、都會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度;硝酸纖維素膜的質(zhì)量,特別是其孔徑的大小和均勻度,會(huì)影響可供抗體蛋白質(zhì)結(jié)合的表面積以及樣本通過(guò)的毛細(xì)流速,從而影響靈敏度;吸水紙等材料的性能,金標(biāo)抗體的濃度、用量,所加的各種穩(wěn)定劑、調(diào)節(jié)劑的種類和量,保存條件等都會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)試結(jié)果。所以,必須經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)工作摸索,嚴(yán)格操作,才能保證試紙條的批間差異小于要求值。