DNA甲基化檢測的序曲——亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
檢測DNA甲基化的方法有很多種，在眾多方法中，研究人員常常會(huì)使用到一項(xiàng)技術(shù)，那就是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。DNA的亞硫酸氫鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。隨后用測序、定量PCR和芯片等分析來比較處理和未處理DNA的序列，就能確定哪些堿基是甲基化的。
盡管在理論上很簡單，但亞硫酸氫鹽處理真正要做起來卻不那么容易。如果你問一問那些做過的人，他們八成會(huì)告訴你不好做。首先是回收率不高，會(huì)損失大量DNA，有時(shí)甚至達(dá)到50%。其次是轉(zhuǎn)化效率，有時(shí)是未能徹底轉(zhuǎn)化，有時(shí)則是轉(zhuǎn)化過了頭。此外，還要面臨DNA的降解。因?yàn)閬喠蛩釟潲}處理的劇烈條件，DNA會(huì)片段化，從而降低了PCR及后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。
目前市場上有多個(gè)廠家提供亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，包括QIAGEN、默克密理博、Sigma-Aldrich、Zymo、Life Technologies等。
在選購時(shí)，我們應(yīng)注意關(guān)鍵的幾點(diǎn)。首先，確保所有的未甲基化CpG位點(diǎn)都能完全轉(zhuǎn)化，才能獲得可靠的結(jié)果。另外，我們還要關(guān)心DNA是否能夠高效回收。方法不同，實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間也有差異。傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化需要過夜孵育，而最新推出的試劑盒往往只需要1-3小時(shí)。
對(duì)于新手來說，最好還是買完整的試劑盒。試劑盒中的試劑和操作步驟經(jīng)過優(yōu)化，容易得到更加一致的結(jié)果。有些試劑盒中還帶有對(duì)照。有些人可能覺得對(duì)照可有可無，然而一旦出了問題，它的重要性就凸顯了。
默克密理博——CpGenome? Turbo Bisulfite Modification Kit
這款極速重亞硫酸鹽處理試劑盒能為你帶來飛一般的感覺，讓你體驗(yàn)極為快速的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。使用這一款極速重亞硫酸鹽處理試劑盒，從DNA樣品處理到轉(zhuǎn)化后的高純DNA只需90分鐘。它的秘密就在于一款受ZL保護(hù)的處理試劑，能在很短時(shí)間內(nèi)將未甲基化的胞嘧啶徹底轉(zhuǎn)化。同時(shí)這種試劑對(duì)DNA的傷害又極小，不像通常的高鹽、高溫以及低pH等極端條件會(huì)導(dǎo)致DNA高度片段化。至于這種處理試劑的成分，我們當(dāng)然無從得知，只知道它是由兩種試劑混合而成。有了它，轉(zhuǎn)化即可在40分鐘內(nèi)完成，耗時(shí)僅為其他方法的1/10。
也許你又有點(diǎn)擔(dān)心轉(zhuǎn)化的效果，快是快了，但會(huì)不會(huì)轉(zhuǎn)化不完全呢？其實(shí)，這款試劑盒的修飾轉(zhuǎn)化效率高達(dá)99.9%。無論是1 ng DNA，還是1 μg DNA樣品，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒都一視同仁，產(chǎn)生靈敏且可靠的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)果。
有時(shí)，過度轉(zhuǎn)化也是一個(gè)大問題。不過，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒可有一雙雪亮的眼睛，只會(huì)徹底轉(zhuǎn)化非甲基化的胞嘧啶，而絲毫不會(huì)轉(zhuǎn)化甲基化的胞嘧啶！研究人員做過實(shí)驗(yàn)，用極速重亞硫酸鹽處理試劑盒處理甲基化DNA和非甲基化DNA，然后用CpG Wiz? MGMT引物對(duì)進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，在所有檢測的樣本中，極速重亞硫酸鹽處理試劑盒僅特異地徹底地轉(zhuǎn)化了非甲基化胞嘧啶，而完全沒有轉(zhuǎn)化甲基化胞嘧啶。這個(gè)特點(diǎn)最大限度地維護(hù)了我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。
QIAGEN——EpiTect Bisulfite Kit
QIAGEN的EpiTect Bisulfite Kit 采用簡單的流程，可在6小時(shí)將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，且手工操作極少，而傳統(tǒng)方法需要18個(gè)小時(shí)。整個(gè)過程只需上樣、洗滌、洗脫這幾個(gè)簡單的步驟。DNA經(jīng)過熱變性和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，被上樣到EpiTect分離柱或96孔板上，使用優(yōu)化的緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)化的離心步驟或真空裝置，洗去所有的亞硫酸氫鈉并洗脫DNA。洗脫的DNA可用于各種下游應(yīng)用，如甲基特異性PCR，定量PCR分析，亞硫酸氫鹽測序，結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性內(nèi)切酶法分析（COBRA）以及焦磷酸測序（Pyrosequencing）。
以往，研究人員總是為轉(zhuǎn)化效率太低而苦惱，而EpiTect Bisulfite Kit 采用全新的保護(hù)機(jī)制防止DNA降解，即使是1 ng的DNA也能獲得靈敏的結(jié)果，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%。而且試劑盒對(duì)不同的起始樣品量一視同仁，無論是低至1 ng的DNA，還是高至2 μg的DNA，試劑盒都以相同的效率轉(zhuǎn)化。對(duì)于微量樣本，轉(zhuǎn)化后的DNA還可用EpiTect Whole Bisulfitome Kit進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。該試劑盒采用等溫多重代替擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，可從50 ng 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA 擴(kuò)增得到1-3 μg DNA，足夠下游100-300 次MSP實(shí)驗(yàn)使用。
至于轉(zhuǎn)化之后的DNA回收，那向來是QIAGEN的拿手好戲。QIAGEN使用經(jīng)典的硅膠膜技術(shù)，確保 85%以上的回收率，同時(shí)還可以高特異性地去除亞硫酸氫鹽等對(duì)后續(xù)PCR有抑制作用的組分。
此外，試劑盒中的DNA保護(hù)緩沖液也非同一般。它采用獨(dú)特的配方，防止DNA過度片段化，保證后續(xù)大PCR片段的擴(kuò)增和分析，并實(shí)現(xiàn)有效的DNA變性，從而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化所需的單鏈DNA。這一有效的完整DNA回收確保轉(zhuǎn)化后的DNA可保存長達(dá)18個(gè)月，而如果使用自制試劑轉(zhuǎn)化DNA，則只能保存短短的2-4周。DNA保護(hù)緩沖液還包含有pH指示劑染料，從而保證胞嘧啶轉(zhuǎn)化時(shí)正確的pH條件。這款試劑盒的價(jià)格為2610元/48次，單次價(jià)格約為54元。
Sigma-Aldrich——Imprint? DNA Modification Kit
也許很多人都不知道，但Sigma-Aldrich真的提供了不少表觀遺傳學(xué)產(chǎn)品，包括亞硫酸氫鹽修飾、ChIP等試劑盒，只是比較低調(diào)，宣傳得不多而已。這款I(lǐng)mprint? DNA Modification Kit在性能上也確實(shí)不錯(cuò)，只需2小時(shí)即可完成整個(gè)轉(zhuǎn)化步驟。DNA變性和亞硫酸氫鹽修飾是同時(shí)進(jìn)行的。在修飾過程中，亞硫酸氫鹽與單鏈DNA反應(yīng)，脫掉胞嘧啶的氨基，形成尿嘧啶。獨(dú)特的DNA保護(hù)試劑防止DNA的化學(xué)和熱降解。而捕獲溶液能讓DNA與過濾柱緊密結(jié)合，從而高效去除亞硫酸氫鈉和鹽。洗脫后的DNA立即可用，或儲(chǔ)存在-20°C，最多2個(gè)月。
說明書中提到，對(duì)于最佳的修飾，DNA量應(yīng)當(dāng)在50-200 ng之間，不過100 ng-1 μg的DNA也可成功修飾。它提供了兩種修飾步驟，供你靈活選擇。若DNA量較多，如10 ng-1 μg，可選擇一步法修飾；反之，若DNA在100 pg-10 ng之間，則推薦兩步法。BSA可作為載體蛋白，改善低濃度DNA的回收，不過試劑盒中未提供，需自己另購。
除了快，Imprint DNA Modification Kit也極為智能， 99%以上的未甲基化胞嘧啶都能轉(zhuǎn)化。至于處理和純化后的DNA回收率，一般在50%以上。修飾后的DNA可用于下游的甲基特異性PCR、焦磷酸測序和甲基化芯片。試劑盒中包含了轉(zhuǎn)化所需的所有試劑。50次反應(yīng)的價(jià)格為2,577.51元，每次價(jià)格約為50元。
Zymo Research——EZ DNA Methylation? kits
Zymo Research的DNA甲基化產(chǎn)品也是深受廣大科研工作者的喜愛。它提供了三款亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒：EZ DNA Methylation Kit、EZ DNA Methylation-Gold Kit和EZ DNA Methylation-Direct Kit。
EZ DNA Methylation-Gold Kit 是EZ DNA Methylation Kit的改進(jìn)版。EZ DNA Methylation-Gold Kit 將 DNA 變性過程和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程合成一步，使整個(gè)過程更快，可在3小時(shí)內(nèi)完成。此步驟采用溫度變性來取代之前方案中使用氫氧化鈉的化學(xué)變性過程。轉(zhuǎn)化之后，試劑盒可回收75%以上的DNA。
試劑盒的設(shè)計(jì)可以減少模板降解和純化過程中的DNA損失，并且完全轉(zhuǎn)化未甲基化的胞嘧啶。據(jù)Zymo介紹，轉(zhuǎn)化效率在99%以上。回收的DNA對(duì)于PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶消化、測序、芯片等下游分析是很理想的。
若你的樣品量很少，Zymo還提供了另外一個(gè)好選擇——EZ DNA Methylation-Direct Kit。它能夠徹底轉(zhuǎn)化來自血液、組織、細(xì)胞、FFPE和LCM樣品中的DNA，而事先無需純化。這款試劑盒的靈敏度更高，即使10個(gè)細(xì)胞或50 pg DNA也能對(duì)付，DNA回收率在80%以上。與上面的EZ DNA Methylation-Gold Kit一樣，DNA 變性和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是一步完成的。這幾款試劑盒都有離心柱和96孔板形式可供選擇。
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Life Technologies——Cells-to-CpG? Bisulfite Conversion Kit
Life Technologies的這一款試劑盒與上面Zymo的那個(gè)Direct有些類似，可以直接從細(xì)胞、組織或血液開始。直接裂解并變性樣品，隨后亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，脫鹽，脫磺酸基，整個(gè)步驟在3小時(shí)內(nèi)完成。若是從純化的基因組DNA開始，需要100 ng至1 μg；對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，需要5000至105個(gè)；若是血液，則需要2.5 μl。
Cells-to-CpG? 系統(tǒng)包含了從直接樣品轉(zhuǎn)化到純化所需的全部組分，提供了一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證、靈活簡化的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方案，適合實(shí)時(shí)定量PCR、毛細(xì)管電泳和新一代測序的流程。試劑盒有兩種規(guī)格：50次反應(yīng)和2×96孔板，供你靈活選擇。
除了這個(gè)試劑盒，Life Tech還提供了兩款對(duì)照，包括Cells-to-CpG? Methylated and Unmethylated gDNA Control Kit和Cells-to-CpG? Bisulfite Conversion & Quantitation Control Kit。結(jié)合這些經(jīng)過驗(yàn)證的對(duì)照，Cells-to-CpG? Bisulfite Conversion Kit可為大家?guī)矶可峡煽康慕Y(jié)果。
對(duì)于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化這個(gè)過程來說，我們的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)未甲基化DNA到尿嘧啶的~100%轉(zhuǎn)化，同時(shí)最大限度地回收DNA。新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，讓我們離這個(gè)目標(biāo)越來越近了。
