甲基化檢測(cè)方法介紹
(1) 甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。
(2)亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。
(3) 高分辨率熔解曲線法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。
(4) 基因組直接測(cè)序法
基因組直接測(cè)序法是過(guò)去一直沿用的DNA甲基化的研究方法，用Maxam—Gilbert化學(xué)裂解法對(duì)基因組DNA進(jìn)行處理，并以連接介導(dǎo)的PCR來(lái)放大信號(hào)強(qiáng)度，然后進(jìn)行序列分析。此法是基于5mC在標(biāo)準(zhǔn)的Maxam—Gilbert胞嘧啶化學(xué)裂解反應(yīng)中不被裂解，故5mC可通過(guò)在測(cè)序膠上缺少對(duì)應(yīng)于胞嘧啶降解反應(yīng)產(chǎn)物的一個(gè)條帶而得以鑒定。如采用MnO4-?哌啶法，結(jié)果則反之因此在檢測(cè)5mC時(shí)，此兩法可提供完全互補(bǔ)的檢測(cè)信息。該法與LM-PCR結(jié)合后，大大降低了對(duì)基因組DNA的需要量（1～2 ng）。當(dāng)5mC和C同時(shí)處于不同DNA分子上的同一位點(diǎn)時(shí)，該位點(diǎn)至少要有25%的5mC才能被N2H4法檢測(cè)到；MnO4-法比N2?H4法更靈敏。因?yàn)檫@兩種基因組DNA化學(xué)修飾法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性，無(wú)須進(jìn)行DNA哌啶裂解就可通過(guò)基因組直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行甲基化分析。
