臨床微生物檢驗質(zhì)量控制要求
??? 臨床微生物檢驗是人體的各種物質(zhì)進(jìn)行微生物學(xué)檢驗，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。整個檢驗過程包括病人樣品的采集、運(yùn)送、處理，樣品中致病微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定，藥物敏感試驗，出具檢驗報告。
為了保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確無誤，應(yīng)對分析前、分析中、分析后三個階段實行全面質(zhì)量管理。質(zhì)量控制是全面質(zhì)量管理內(nèi)容的一部分，主要針對分析中這一階段，通過采取各種措施來確保檢驗結(jié)果正確。影響分析中階段的因素很多，現(xiàn)就其主要因素和我們采取的質(zhì)量控制要求分析如下：
一、人員的資格及操作熟練程度
由于臨床微生物檢驗的所有試驗都是中度或高度復(fù)雜的試驗，其特點為①不能完全脫離手工；②以定性試驗為主；③主觀判斷機(jī)會較多。在操作過程的每一個環(huán)節(jié)都會出現(xiàn)變化，因而人的資歷、專業(yè)經(jīng)驗、檢驗?zāi)芰?、操作熟練程度尤為重要?CLIA 88 曾對不同實驗室檢驗人員做出規(guī)定：中度復(fù)雜實驗室的檢驗人員應(yīng)經(jīng)過訓(xùn)練，能進(jìn)行檢驗，并有標(biāo)本收集、合理使用儀器以及評價檢驗結(jié)果有效性的能力；高度復(fù)雜實驗室的檢驗人員必須是檢驗專業(yè)畢業(yè)的學(xué)士、碩士或博士，是有資格的、接受過培訓(xùn)并能進(jìn)行相應(yīng)檢驗的人員。國內(nèi)對不同技術(shù)職稱人員提出的要求是高級職稱人員應(yīng)掌握國內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)，及時了解專業(yè)發(fā)展的前沿狀況，獨(dú)立解決重大關(guān)鍵性技術(shù)問題，有較強(qiáng)的處理復(fù)雜工作的能力，能正確解釋檢驗結(jié)果的臨床意義，組織參與危重病人搶救，參與會診、技術(shù)咨詢、儀器試劑的選擇和論證；中級人員應(yīng)熟悉同內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)，及時了解專業(yè)發(fā)展的前沿狀況，獨(dú)立解決一些關(guān)鍵技術(shù)問題，有處理復(fù)雜工作的能力，能正確解釋檢驗結(jié)果的臨床意義，參與危重病人搶救、會診、技術(shù)咨詢；初級人員應(yīng)了解國內(nèi)先進(jìn)技術(shù)、專業(yè)發(fā)展的前沿狀況，在上級人員指導(dǎo)下解決一般技術(shù)問題，能正確解釋檢驗結(jié)果的臨床意義，參與技術(shù)咨詢。
為了保證檢驗質(zhì)量，對接受過一定專業(yè)理論、專業(yè)技術(shù)教育與培訓(xùn)的上崗人員要進(jìn)行定期的考核， 以測試他們的檢驗?zāi)芰安僮魇炀毘潭?。考核的方式有多種，一種是明確地告訴操作人員，讓其有思想準(zhǔn)備；另一種是不通知對方，將考核樣品混同日常檢驗樣品作為常規(guī)工作?？己藘?nèi)容可針對檢驗項目的某一環(huán)節(jié)?？己藰悠房梢允巧唐坊馁|(zhì)控品，也可由實驗室制備。無論采取哪種形式，哪種樣品，重要的是不得將考核樣品作“特殊對待”，而應(yīng)當(dāng)作常規(guī)工作處理。每個檢驗人員都要接受繼續(xù)教育，接受新的專業(yè)理論，學(xué)習(xí)新的專業(yè)技術(shù)、掌握新型儀器的操作使用和維護(hù)，不斷提高檢驗水平。
二、操作手冊 ( 作業(yè)指導(dǎo)書 )
實驗室應(yīng)具備一本包括所有檢驗項目操作方法與質(zhì)控方法的操作手冊，由高年資人員編寫。不同級別的醫(yī)院應(yīng)根據(jù)各自實驗室的條件與所開展項目，制定切合實際的操作手冊。編寫時盡可能參照國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、國際標(biāo)準(zhǔn)、國內(nèi)外參考文獻(xiàn)中的相應(yīng)部分，使方法標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。操作手冊生成后應(yīng)經(jīng)室主任批準(zhǔn)簽字，注明日期，并放置在工作場所，以便翻閱。手冊中任何改變均應(yīng)有科主任批準(zhǔn)簽字注明日期。一旦科室領(lǐng)導(dǎo)更換應(yīng)由現(xiàn)科室主任批準(zhǔn)簽字，注明日期。停止使用的操作手冊副本應(yīng)保留二年后再予銷毀。作為臨床微生物檢驗操作手冊至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：
(1) 樣品采集、運(yùn)送與處理， (2) 樣品檢驗流程， (3) 檢驗方法與質(zhì)控方法 (?細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鑒定與藥物敏感試驗 ) ， (4) 臨床意義， (5) 報告方式， (6) 儀器操作手冊， (7) 試劑質(zhì)量鑒定， (8) 質(zhì)控控制， (9) 實驗室管理的各項規(guī)章制度 (?生物安全制度、內(nèi)務(wù)管理制度、樣品管理制度等 ) 。
三、儀器設(shè)備的質(zhì)控
臨床微生物實驗室最常用的儀器設(shè)備是光學(xué)顯微鏡、溫箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、冰箱與低溫冰箱、壓力蒸汽滅菌器等。這些儀器設(shè)備的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)見表 1 。
表 1 臨床微生物實驗室常用儀器設(shè)備的質(zhì)量控制
儀器設(shè)備名稱 | 控制標(biāo)準(zhǔn) | 允許范圍 | 監(jiān)控方法和頻率 |
光學(xué)顯微鏡 | 每年 4 次或需要時，作清潔與調(diào)試 | ||
培養(yǎng)箱 | 35 ℃ | ± 1 ℃ | 每天觀察記錄溫度 |
二氧化碳培養(yǎng)菌 | 每天觀察記錄溫度和 | ||
溫度 | 35 ℃ | ± 1 ℃ | 二氧化碳濃度 |
氣體 | 5%-10% | <10% | |
冰箱 | 每天觀察記錄溫度 | ||
冷藏室 | 4 ℃ | ± 2 ℃ | |
冷凍室 | -5 ℃ | ± 1 ℃ | |
低溫冰箱 | -20 ℃ | ± 5 ℃ | 每天觀察記錄溫度 |
壓力蒸汽滅菌器 | 121 ℃ | ≥ 121 ℃ | 使用時觀察并記錄溫度、壓力，每周用嗜熱芽孢菌或每次用化學(xué)方法測試滅菌效果 |
隨著醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)科的不斷發(fā)展，許多自動化儀器和微量生化反應(yīng)系統(tǒng)相繼進(jìn)入微生物實驗室。給細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)、鑒定與藥敏試驗帶來快速準(zhǔn)確的結(jié)果。對于這些儀器設(shè)備的質(zhì)量控制，可根據(jù)廠商說明書推薦的方法去做，確保測試系統(tǒng)的靈敏度和精密度。
四、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制
用于各種臨床標(biāo)本中微生物分離、鑒定的培養(yǎng)基種類很多。以前，都由實驗室自配，現(xiàn)在已有成品供應(yīng)。無論成品培養(yǎng)基還是自制培養(yǎng)基，其質(zhì)量好壞直接影響微生物檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此必須對培養(yǎng)基作以下三方面質(zhì)控。
1 ．一般性狀
培養(yǎng)基的一般性狀包括外觀、厚度、 pH 值等。剛配制的液體培養(yǎng)基，其外觀應(yīng)透明、清亮、無混濁、無沉淀，顏色符合要求。新鮮的固體培養(yǎng)基應(yīng)具有特定的顏色，表面濕潤但無水汽、平整、光潔無凹坑和氣泡。整塊平板厚薄均勻，一般厚度在 3mm ，但 MH 平板的厚度不得小于 4mm 。斜面的長度不得超過試管長度的 2 ／ 3 。應(yīng)經(jīng)常觀察貯存培養(yǎng)基的質(zhì)量是否合格。若試管內(nèi)液體培養(yǎng)基液面降低，表明水分蒸發(fā)，培養(yǎng)基濃縮。當(dāng)固體培養(yǎng)基發(fā)生顏色改變，表面干燥，出現(xiàn)裂紋或邊緣的瓊脂與平板或試管分離時，應(yīng)不再使用。培養(yǎng)基的 pH 是細(xì)菌生長的重要條件之一，一般而言合格培養(yǎng)基的 pH 應(yīng)在規(guī)定值上下 0.2 的范圍內(nèi)。
2 ．無菌試驗
新制備的培養(yǎng)基要按批號隨機(jī)抽取一定數(shù)量的樣品作無菌試驗。對于壓力蒸氣滅菌后傾注的固體培養(yǎng)基，抽樣后放 35 ℃ ± 1 ℃ 溫箱培養(yǎng) 24-48h ；滅菌后經(jīng)無菌操作分裝的液體培養(yǎng)基要全部放入 35 ℃ ± 1 ℃ 溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h ；對有些無需高壓滅菌只需煮沸消毒的選擇性培養(yǎng)基要取部分瓊脂，放入無菌肉湯管培養(yǎng) 24h ：上述試驗證實無細(xì)菌生長時才算合格。若有細(xì)菌生長，說明培養(yǎng)基制備過程中已受雜菌污染，除了尋找原因外，應(yīng)不再使用。
3 ．細(xì)菌生長試驗
所有的培養(yǎng)基在使用前除了做無菌試驗外還必須做細(xì)菌生長試驗以測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。要用已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株按照 NCCLS 推薦的方法作質(zhì)控。質(zhì)控所需的標(biāo)準(zhǔn)菌株分 2 種：一種是已知的可在某種培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生典型生物學(xué)性狀的，對培養(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陽性反應(yīng)的菌株；另一種是用已知的不能在某種培養(yǎng)基上生長或?qū)ε囵B(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陰性生化反應(yīng)的菌株。表 2 列出 10 種常用固體培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)及所需標(biāo)準(zhǔn)菌株。
無論是廠家的成品培養(yǎng)基還是實驗室自制的培養(yǎng)基，都應(yīng)經(jīng)過上述三方面的檢驗才能證實其質(zhì)量是否合格。廠家應(yīng)將所做的試驗內(nèi)容形成書面的質(zhì)量鑒定送交客戶保存。實驗室自行配制過程中應(yīng)對上述鑒定內(nèi)容有明確記載。此外還應(yīng)對培養(yǎng)基配制原料的性狀、批號、失效期以及配制過程各個環(huán)節(jié)的操作形成記錄。表 2 12 種常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定
表 2 12 種常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定
培養(yǎng)基名稱 | 質(zhì)控菌株 | ATCC | 鑒定標(biāo)準(zhǔn) |
血平板 | 金黃色葡萄球菌 | 25923 | 中度到大量生長 |
巧克力平板 | 流感嗜血桿菌 | 10211 | 生長 |
伊紅美藍(lán)平板 | 鼠傷寒沙門菌 | 14028 | 生長，無色到琥珀色菌落 |
麥康凱平板 | 大腸埃希菌 | 25922 | 生長，紅色菌落 |
SS 平板 | 鼠傷寒沙門菌 | 14028 | 生長，無色菌落，有或無黑心 |
TCBS 平板 | 霍亂弧菌 | 9459 | 生長，黃色菌落 |
營養(yǎng)瓊脂平板 | 福氏志賀菌 | 12022 | 中度到大量生長 |
羅氏培養(yǎng)基 | 結(jié)核分枝桿菌 H37Rａ | 25177 | 生長 |
淋病選擇性 | 淋病奈瑟菌 | 43096 | 生長 |
五 . 試劑質(zhì)控
臨床微生物實驗室常用的試劑包括染色液、診斷血清以及各種生化反應(yīng)試劑等。
1. 染色液質(zhì)控
細(xì)菌室最常用的染色液是革蘭染色液和抗酸染色液。對自制的染色液，要求將整個配制過程的操作步驟形成記錄并保存。配好的染色液應(yīng)貼上寫有染色液名稱、配制日期、配制人的標(biāo)簽。初次使用時必須用革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作質(zhì)量鑒定，以證實染色液配制無誤。商品化染色液應(yīng)對品牌、試劑名稱、批號、存放條件、失效期。廠家應(yīng)向客戶提供染色液鑒定的質(zhì)量保證書。按照 CLIA88 的規(guī)定，染色液應(yīng)每周作一次質(zhì)量控制。用金黃色葡萄球菌 (ATCC25923) 。大腸埃希菌 (ATCC 25922) 作革蘭染色液的室內(nèi)質(zhì)控。用結(jié)核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 25177) 對抗酸染色液進(jìn)行質(zhì)量鑒定。過期的染色液應(yīng)不再使用。
2. 常用生化試劑的質(zhì)控
隨著細(xì)菌鑒定儀和快速微量生化鑒定板條的普及，臨床微生物檢驗常用的生化試劑種類日趨減少，對這些試劑的質(zhì)控要求見表 3 。此外應(yīng)注意在用試劑在貯存時的避光、冷藏等要求，保證試劑的穩(wěn)定性。不要使用過期的試劑。
3. 診斷血清的質(zhì)控
診斷血清是一種重要的細(xì)菌鑒定的試劑，應(yīng)從有資質(zhì)的生產(chǎn)單位購買。驗收時必須看清生產(chǎn)批號、血清效價、透明度與色澤。初次使用時應(yīng)注意：工作濃度并與原用的診斷血清對照比較后再用于病人樣品的測試。試驗中應(yīng)注意無菌操作，避免細(xì)菌污染。要經(jīng)常檢查貯存在 4 ℃ 冰箱中的各種血清，若發(fā)現(xiàn)混濁，出現(xiàn)絮狀，應(yīng)停止使用。為保證血清凝集反應(yīng)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)每 3 個月對血清進(jìn)行一次質(zhì)控。不要使用過期的血清。
表 3 常用試劑的質(zhì)量鑒定
試劑名稱 | 陽性對照菌種 | 陰性對照菌種 | 監(jiān)控頻率 |
凝固酶血漿 | 金黃色葡萄球菌 | 表皮葡萄球菌 | 每天 |
桿菌肽 | A 群鏈球菌 | B 群鏈球菌 | 每周 |
Optochin 紙片 | 肺炎鏈球菌 | 每周 | |
10% 去氧膽酸鈉 | 肺炎鏈球菌 | 每周 | |
三氯化鐵 | B 群鏈球菌 | A 群鏈球菌 | 每次 |
過氧化氫 | 金黃金葡萄球菌 | A 群鏈球菌 | 每天 |
氧化酶 | 銅綠假單胞菌 | 大腸埃希菌 | 每天 |
甲基紅試劑 | 大腸埃希菌 | 產(chǎn)氣腸桿菌 | 每周 |
VP 試劑 | 產(chǎn)氣腸桿菌 | 大腸埃希菌 | 每周 |
三氯化鐵 | 奇異變形桿菌 | 大腸埃希菌 | 每周 |
“ X ”因子條狀物 | 嗜沫嗜血桿菌 | 副流感嗜血桿菌 | 每周 |
“?V ”因子條狀物 | 副流感嗜血桿菌 | 流感嗜血桿菌 | 每周 |
“ X+V ”因子條狀物 | 流感嗜血桿菌 | 每周 | |
芽管血清 | 白色念珠菌 | 熱帶念珠菌 | 每次 |
六、抗微生物藥物敏感試驗的質(zhì)控
藥物敏感試驗是臨床微生物檢驗的重要步驟之一。其結(jié)果正確與否涉及治療效果的好壞，病人住院時間的長短及其對服務(wù)質(zhì)量是否滿意。常用的試驗方法有紙片法和稀釋法。影響藥敏試驗的因素很多，如 0.5 號麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管未搖勻或變質(zhì)；接種的菌懸液太淡或太濃；紙片在取用或貯存的過程中失效； MH 培養(yǎng)基的質(zhì)量不合格；平板孵育的時間、溫度、氣體偏離標(biāo)準(zhǔn)；操作人員的技術(shù)不夠熟練等，這些影響因素均可通過藥敏試驗室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果發(fā)現(xiàn)問題。
藥敏試驗的室內(nèi)質(zhì)控開始時必須建立一個質(zhì)控系統(tǒng)。在滿足上述條件后，用各種藥物與標(biāo)準(zhǔn)菌株配成不同組合，同一組合測連續(xù) 30 d 抑菌圈 ( 紙片法 ) 直徑或 MIC 值 ( 稀釋法 ) 。在 30 個數(shù)據(jù)中只能允許 3 個數(shù)據(jù)失控。這時可將每日質(zhì)控改為每周質(zhì)控，，每周質(zhì)控時，若有一個數(shù)據(jù)失控，應(yīng)立即查找原因。找到原因后連續(xù)做 5 d 質(zhì)控，若 5 d 數(shù)據(jù)均在控，說明原因已找到，可改為每周質(zhì)控；若連續(xù) 5 d 數(shù)據(jù)中出現(xiàn)一個數(shù)據(jù)失控說明尚未找到真正的原因，應(yīng)繼續(xù)查找。在恢復(fù)每周質(zhì)控前仍應(yīng)有連續(xù) 30 d 質(zhì)控數(shù)據(jù)支持。
質(zhì)控系統(tǒng)包括： (1) 經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)，掌握藥敏試驗操作方法的人員； (2) 要有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，其中包括藥敏試驗方法、標(biāo)準(zhǔn)菌株種類及應(yīng)用、藥敏試驗的質(zhì)控方法及允許范圍、藥物種類選擇與判斷標(biāo)準(zhǔn)等； (3) 有試驗所需的質(zhì)控菌株 ( 藥物敏感試驗中所需標(biāo)準(zhǔn)菌株名稱與實際應(yīng)用見表 4) ； (4) 使用質(zhì)量合格的消耗性檢驗材料； (5) 儀器設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)正?？刂茦?biāo)準(zhǔn)在允許范圍內(nèi)。
質(zhì)控系統(tǒng)健全后即可對外作相應(yīng)檢驗。一旦發(fā)現(xiàn)藥敏質(zhì)控試驗數(shù)據(jù)失控時，不應(yīng)對外發(fā)藥敏試驗報告。此外，在更換藥敏紙片、藥敏試驗板條、 MH 培養(yǎng)基、 0.5 單位麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管的批號時應(yīng)作室內(nèi)質(zhì)控。在能力比對試驗中，檢測待檢菌藥物敏感性的同時應(yīng)作質(zhì)控試驗。
表 4 NCCLS 的 M2-A6 與 M7-A4 文件中推薦的質(zhì)控菌株
菌名 | 標(biāo)準(zhǔn)菌株編號 | 用途 | |
大腸埃希菌 | ATCC | 25922 | 用于腸桿菌科細(xì)菌藥敏試驗的質(zhì)控 |
大腸埃希菌 | ATCC | 35218 | 用于β - 內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥的質(zhì)控 |
金黃色葡萄球菌 | ATCC | 25923 | 用于葡萄球菌屬或腸球菌屬細(xì)菌藥敏試驗（紙片法）的質(zhì)控 |
金黃色葡萄球菌 | ATCC | 29213 | 用于葡萄球菌屬或腸球菌屬細(xì)菌藥敏試驗（稀釋法）的質(zhì)控 |
銅綠假單胞菌 | ATCC | 27853 | 用于銅綠假單胞菌和不動桿菌屬細(xì)菌的藥敏試驗的質(zhì)控；測試 MH 平板中二價陽離子對氨基糖苷類和四環(huán)素針對銅綠假單胞菌的抑菌效果 |
糞腸球菌 | ATCC | 29212 | 用于監(jiān)測 MH 培養(yǎng)基中胞腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶對磺胺類和甲氧芐啶的抑菌效果；用于高含量氨基糖苷類紙片的質(zhì)控 |
流感嗜血桿菌 | ATCC | 49247 | 用于流感嗜血桿菌屬細(xì)菌藥敏試驗的質(zhì)控 |
流感嗜血桿菌 | ATCC | 49766 | 用于流感嗜血桿菌屬細(xì)菌藥敏試驗的質(zhì)控 |
淋病奈瑟菌 | ATCC | 49266 | 用于淋病奈瑟菌藥敏試驗的質(zhì)控 |
肺炎鏈球菌 | ATCC | 49619 | 用于肺炎鏈球菌藥敏試驗的質(zhì)控 |
如對本文感興趣，請參閱《臨床檢驗及實驗室設(shè)備》2005年6月第七卷第2期
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