二喹啉甲酸（BCA）檢測法測定蛋白質濃度實驗
二喹啉甲酸（BCA）檢測法是近來新研制的一種改進的 Lowery 測定法，反應簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質的影響。
| 實驗方法原理 | 在堿性環(huán)境下蛋白質分子中的肽鍵結構能與 Cu2＋絡合生成絡合物，同時將 Cu2＋還原成 Cu＋。而 BCA 試劑可敏感特異地與結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物。 在 562nm 處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質的含童。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 溶液 1.1 試劑 A，1L 10 g BCA （1％） 20 g Na2CO3·H2O） （2％） 1.6 g Na2C4H4O6（·2 H2O） （0.16％） 4 g NaOH （0.4％） 9.5 g NaHCO3?（0.95） 加水至 1L，用 NaOH 或固體 NaHCO3?調節(jié) pH 值至 11.25。 1.2 試劑 B，50 ml 2 g CuSO4·5 H2O（4％） 加雙蒸水至 50 ml 試劑 A 和試劑 B 在室溫下至少穩(wěn)定 12 個月，并可購買商品化試劑。 1.3 標準工作試劑（SWR） 50 份試劑 A 1 份試劑 B 可穩(wěn)定一周。 2. 檢測 2.1 將 1 倍體積樣品與 20 倍體積的 SWR 混合（例如：100 ul 樣品加入 2 ml SWR）； 2.2 在室溫孵育 2 h（a）或 37℃ 30 min（b）； 2.3 在（b）情況下冷至室溫； 2.4 在 562 nm 讀取光密度（OD） 值。 展開? |
| 注意事項 | 1. 為促進 BCA 法的反應進程，可將實驗試管置于微波爐中孵臺 20s 以內。 2. 在樣品冷卻至室溫后。 每 10 min 光吸收值升高 2.3％。 3. BCA 法檢測微量蛋白靈敏度 0.5～10 ug/ml，應采用濃縮試劑，并需要在 60℃ 反應 60 min。 4. 與 Lowry 法相比，采用 BCA 法時，如果樣品中含有脂類物質將明顯提高光吸收值。 5. 在含巰基試劑和去垢劑的緩沖液中 BCA 呈色發(fā)生變化。 6. 蛋白質樣品經(jīng) DOC-TCA 沉淀后，會去除多數(shù)干擾物質。 展開 |
