二喹啉甲酸（BCA）檢測法測定蛋白質(zhì)濃度實驗
實驗方法原理
在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與 Cu2＋絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時將 Cu2＋還原成 Cu＋。而 BCA 試劑可敏感特異地與結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物。 在 562nm 處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含童。
實驗材料 待測蛋白質(zhì)樣品
試劑、試劑盒 BCANaOH碳酸鈉碳酸氫鈉五水硫酸銅酒石酸鈉
儀器、耗材 分光光度計 37℃水浴鍋小燒杯移液管槍頭和加樣槍試管試管架
實驗步驟
1. 溶液
1.1 試劑 A，1L
10 g BCA （1％）
20 g Na2CO3·H2O） （2％）
1.6 g Na2C4H4O6（·2 H2O） （0.16％）
4 g NaOH （0.4％）
9.5 g NaHCO3 （0.95）
加水至 1L，用 NaOH 或固體 NaHCO3 調(diào)節(jié) pH 值至 11.25。
1.2 試劑 B，50 ml
2 g CuSO4·5 H2O（4％）
加雙蒸水至 50 ml
試劑 A 和試劑 B 在室溫下至少穩(wěn)定 12 個月，并可購買商品化試劑。
1.3 標準工作試劑（SWR）
50 份試劑 A
1 份試劑 B
可穩(wěn)定一周。
2. 檢測
2.1 將 1 倍體積樣品與 20 倍體積的 SWR 混合（例如：100 ul 樣品加入 2 ml SWR）；
2.2 在室溫孵育 2 h（a）或 37℃ 30 min（b）；
2.3 在（b）情況下冷至室溫；
2.4 在 562 nm 讀取光密度（OD） 值。
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注意事項
1. 為促進 BCA 法的反應(yīng)進程，可將實驗試管置于微波爐中孵臺 20s 以內(nèi)。
2. 在樣品冷卻至室溫后。 每 10 min 光吸收值升高 2.3％。
3. BCA 法檢測微量蛋白靈敏度 0.5～10 ug/ml，應(yīng)采用濃縮試劑，并需要在 60℃ 反應(yīng) 60 min。
4. 與 Lowry 法相比，采用 BCA 法時，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值。
5. 在含巰基試劑和去垢劑的緩沖液中 BCA 呈色發(fā)生變化。
6. 蛋白質(zhì)樣品經(jīng) DOC-TCA 沉淀后，會去除多數(shù)干擾物質(zhì)。
